Постановка задачи

Гель-электрофорез разделяет фрагменты ДНК по длине: молекулы, несущие отрицательный заряд, движутся в электрическом поле через поры агарозного геля, причём короткие фрагменты проходят сетку геля быстрее длинных. Метод освоен полвека назад, работает устойчиво и используется практически в любой молекулярно-биологической лаборатории. Основные ограничения относятся не к принципу, а к его стандартной реализации.

Полный цикл занимает около двух — двух с половиной часов: расплавить агарозу, залить пластину, дождаться полимеризации, внести пробы, провести разделение, окрасить, задокументировать. Порядка часа из этого времени приходится на ручные операции, выполняемые квалифицированным сотрудником. Результат считывается визуально, и точность оценки длины фрагмента в рутинной практике составляет десятки пар нуклеотидов. Открытая камера с ампликонами остаётся источником контаминации, из-за чего под электрофорез, как правило, выделяют отдельное помещение.

Мы разрабатываем настольный прибор и одноразовый чип с предварительно залитым гелем. Пользователь вносит в чип 1–2 мкл пробы, устанавливает его в прибор и запускает разделение; через пятнадцать минут получает электрофореграмму и рассчитанные длины фрагментов. Плавление агарозы, заливка пластины, работа с УФ-столом и ручное окрашивание из процедуры исключаются.

Откуда берётся выигрыш во времени

Скорость миграции ДНК определяется напряжённостью поля E = U/L. В стандартной горизонтальной камере длина дорожки составляет 8–10 см, и при типичном напряжении 100 В напряжённость оказывается порядка 10 В/см. Сокращение канала разделения до 1–2 см при том же напряжении даёт уже десятки, а при 200 В — сотни вольт на сантиметр. Выигрыш во времени в этой части следует из одной лишь геометрии.

Причина, по которой аналогичный приём не работает в обычном геле, — джоулев нагрев. Удельная выделяемая мощность пропорциональна σ·E², где σ — проводимость буфера, и в большом объёме геля отводить это тепло некуда: гель размягчается, полосы размываются, ДНК деградирует. В микроканале отношение площади поверхности к объёму велико, тепло уходит в подложку, и высокая напряжённость становится допустимой. На том же принципе построены Agilent Bioanalyzer TapeStation.

Отдельно стоит отметить эффект, который на первый взгляд кажется противоречащим интуиции. Диффузионное размытие зоны растёт как σ ∝ √(2Dt), то есть определяется временем разделения. При прочих равных сокращение времени прогона сужает полосу, а не расширяет её, поэтому быстрый электрофорез даёт не худшее, а лучшее разрешение.

Наконец, предварительно залитый гель снимает не только время подготовки, но и основной источник разброса между экспериментами — вариативность ручных операций.

Реализация

Чипы изготавливаются MSLA-печатью фотополимерной смолой. Каналы формируются непосредственно при печати, без литографии и чистой комнаты; себестоимость прототипа составляет десятки рублей, а цикл от правки CAD-модели до готового чипа занимает часы. Для команды, работающей на собственные средства, это оказалось определяющим фактором: конструкцию канала удавалось перебирать десятками вариантов там, где литографический маршрут дал бы одну итерацию в месяц.

Детекция флуоресцентная. Возбуждение — синим светодиодом, регистрация — камерой через эмиссионный фильтр. Здесь есть тонкость, которая стоила нам времени и о которой имеет смысл предупредить: светодиоды бытовых лент, продающиеся как синие, в большинстве случаев люминофорные и несут широкий хвост излучения в области 550–570 нм. Этот хвост проходит через эмиссионный фильтр напрямую и засвечивает детектор. Требуется прямой InGaN-эмиттер с максимумом около 470 нм и, кроме эмиссионного, ещё и возбуждающий полосовой фильтр перед образцом.

Блок высокого напряжения собственной разработки обеспечивает до 10 кВ, управляется с микроконтроллера через цифровой потенциометр в цепи обратной связи.

Обработка сигнала возложена на программную часть: из видеозаписи прогона строится электрофореграмма, по калибровочному маркеру рассчитываются длины фрагментов.

Экономика анализа

Практический выбор в российской лаборатории сегодня стоит не между нашим прибором и Agilent. Автоматические системы капиллярного и чипового электрофореза — TapeStation, Bioanalyzer, QIAxcel — до 2022 года закрывали эту задачу, но сейчас их поставка и сервисное обслуживание затруднены, и лаборатории в массе вернулись к ручному агарозному гелю. Реальная альтернатива нашему чипу — именно он.

Ручной агарозный гельCompact-Lab (план)Agilent TapeStationПриборкамера и источник питания~500 тыс. ₽ (план, не прайс)2,5–10 млн ₽Расходник на анализединицы ₽сотни ₽1 500–5 000 ₽Время оператора~1 час~5 минутминутыИзмеряемые величиныдлина фрагмента (визуально)длина фрагментадлина, концентрация, целостность (DIN/RIN)Доступность в РФдадаограничена

По стоимости расходного материала мы уступаем классическому гелю. Агароза, буфер и краситель в пересчёте на дорожку стоят единицы рублей, наш чип заведомо дороже. Существенно здесь другое: речь идёт о сотнях рублей за анализ, то есть о величине, привычной для рядового лабораторного расходника, а не о тысячах, как у импортных чиповых систем. При такой цене основным аргументом становится не сам расходник, а высвобожденный час работы специалиста и воспроизводимость результата. Если этот час имеет ненулевую стоимость, полная стоимость анализа оказывается сопоставимой с ручным гелем или ниже, при этом результат остаётся цифровым и повторяемым.

По отношению к импортным чиповым системам мы дешевле кратно — и по прибору, и по стоимости анализа, — но и по функциональности пока уступаем. TapeStation, помимо длины фрагмента, выдаёт концентрацию и численную оценку целостности нуклеиновой кислоты. Наш прибор на текущей стадии определяет длину; количественная калибровка по концентрации не завершена. По этой причине геномные центры и пробоподготовку для NGS мы в ближайшие планы не включаем: без валидированной количественной точности выходить в этот сегмент преждевременно. Задача, которую мы решаем, формулируется скромнее — заменить часовую ручную процедуру быстрой, воспроизводимой и доступной.

Текущее состояние

Достигнуто: печать чипов с формированием каналов, воспроизводимое разделение ДНК на фрагментах порядка сотен пар нуклеотидов, регистрация флуоресценции на прототипе оптического тракта, работающий блок высокого напряжения.

Не завершено: оптический тракт в корпусном исполнении (собран стендовый вариант), количественная калибровка по концентрации и алгоритмы оценки целостности, промышленный корпус и серийная сборка. Регистрация в качестве медицинского изделия не проводилась; первая версия предназначена для исследовательских задач.

Начаты пилотные испытания на реальных образцах в двух российских биотехнологических компаниях.

Опрос

Нам не хватает фактических данных о том, как электрофорез используется в чужих лабораториях: сколько прогонов приходится на неделю, какая доля переделывается и по каким причинам, кто принимает решение о закупке оборудования, какая сумма проходит без тендерной процедуры, что оказывается критичнее — скорость, точность или трудозатраты. Расчётом это не восполняется.

Опрос занимает около пяти минут, регистрация и персональные данные не требуются. Он рассчитан на тех, кто работает с электрофорезом непосредственно: сотрудников молекулярно-биологических, генетических, диагностических и производственных лабораторий, аспирантов, преподавателей практикумов.

[ССЫЛКА НА ОПРОС]

Технические вопросы по полям, буферам, печати и оптике готовы обсуждать в комментариях.

Образно говоря, Нобелевскую премию сейчас получили человек денисовский и человек неандертальский. Но это будет уж слишком образно — всё-таки сами по себе денисовцы и неандертальцы никакими научными достижениями не славятся, да и вымерли они давным-давно. Зато они позволяют многое узнать об эволюции человека, и премию дали одному из самых выдающихся исследователей в этой области Сванте Пеэбо (Svante Pääbo) — именно благодаря его работам удалось прочитать геном неандертальца, а список видов Homo пополнился человеком денисовским. Нобелевским лауреатом Пеэбо стал за то, что сумел найти подход к доисторической ДНК, создав тем самым отдельную научную дисциплину — палеогеномику.

Неандертальцы, денисовцы и другие виды людей дошли до нас в виде разрозненных останков. Возраст останков определять давно научились, и, сравнивая их между собой, можно восстановить какие-то этапы человеческой эволюции.

Достаточно давно удалось установить, что человек разумный сформировался в Африке около 300 тыс. лет назад, а человек неандертальский появился около 400 тыс. лет назад в Европе и Передней Азии, и что около 70 тыс. лет назад человек разумный начал расселяться из Африки по другим частям света, встретил неандертальца, и какое-то время оба вида существовали бок о бок.

Какие-то подробности об их сосуществовании оставались неизвестны, хотя гипотезы были разные. Оба человека могли на дух не переносить друг друга, а могли спариваться и давать гибридное и вполне плодовитое потомство — не такое уж редкое явление в дикой природе.

Как мы знаем, человек разумный и человек неандертальский действительно скрещивались, и генетические последствия этого скрещивания достались нам, современным людям. Чтобы найти у нас следы неандертальского генома, нужно было бы проанализировать ДНК из костей неандертальцев. ДНК довольно стойкая молекула, но стойкость её относительна, и если в костях возрастом несколько десятков тысяч лет мы обнаруживаем ДНК, она часто оказывается сильно фрагментированной и модифицированной. Кроме того, её там мало, и она смешана с ДНК бактерий, растений, животных, грибов и т. д.

То есть кусочки доисторической ДНК людей нужно так прочитать (или просеквенировать), чтобы не спутать её с ДНК других живых существ, и чтобы на выходе у нас получился более или менее связный генетический текст, который можно сравнить с геномом современных людей. Именно это и удалось сделать Сванте Пеэбо и его коллегам.

Поначалу всё начиналось с ДНК митохондрий. Она содержит намного меньше генов, чем главная ДНК в клеточном ядре, но зато митохондрий в клетке очень много, и митохондриальная ДНК, соответственно, есть во многих копиях. По митохондриальной ДНК из сорокатысячелетних неандертальских останков удалось понять, что неандертальцы отличаются генетически как от современных людей, так и от шимпанзе.

Зуб денисовского человека

Дальнейшее усовершенствование методов чтения древней ДНК позволило перейти от митохондриальной ДНК к ядерной. К 2010 году Пеэбо с коллегами сумели прочитать неандертальский геном — настолько, чтобы стало возможным подробнее оценить взаимоотношения человека неандертальского и человека разумного. Одним из главных открытий стали те самые следы неандертальской ДНК в геноме современных людей. Её долю оценивают по-разному, но в целом считается, что неандертальской ДНК у нас 1–4% (хотя кто-то говорит и о 20%).

Если от неандертальцев до нас дошли многочисленные и порой весьма сохранные останки, то денисовского человека определили всего лишь по одной фаланге пальца, которую нашли в 2008 г. в Денисовой пещере на Алтае (сейчас останков денисовцев из разных частей света прибавилось, но они пока всё так же немногочисленны). ДНК в фаланге пальца оказалась на удивление сохранной, и, прочтя её, исследователи (то есть тот же Пеэбо с коллегами) поняли, что перед ними новый вид Homo. Денисовцы, как и неандертальцы, тоже «наследили» в геноме современных людей: у выходцев из Меланезии и Юго-Восточной Азии можно найти до 6% денисовской ДНК. Получается, что человек разумный, выйдя из Африки, столкнулся с двумя кузенами: человеком неандертальским в западной части Евразии и человеком денисовским в восточной части Евразии.

Многие из работ Сванте Пеэбо выполнены в теснейшем сотрудничестве с Российской академией наук. Но хотя премию ему вручили за открытия в области эволюции человека, нетрудно понять, что умение целенаправленно анализировать древнюю ДНК может пригодиться в самых разных научных областях.

По материалам Нобелевского комитета

Учёные надеются, что это первый шаг к её «воскрешению».

Додо, или маврикийские дронты (Raphus cucullatus) – крупные нелетающие птицы с массивными клювами – беспечно обитали на Маврикии сотни лет до прибытия туда первых мореплавателей вместе с крысами и свиньями. Популяцию уничтожили целиком уже к 60-м годам XVII.

Дронт был лёгкой добычей для людей, а также для животных, которых моряки привозили с собой на остров. Последнее широко признанное научным сообществом наблюдение птицы в природе было зафиксировано в 1662 году. Всё, что нам осталось от дронтов – это не слишком точные художественные рисунки, немногочисленные останки и мудрый Додо, увековеченный на страницах «Алисы в Стране чудес» Льюиса Кэрролла.

Учёные потратили годы, пытаясь найти хорошо сохранившуюся ДНК птицы, прежде чем им удалось сделать это с помощью образца из Музея естественной истории Копенгагена.

Профессор Бет Шапиро из Калифорнийского университета в Санта-Круз рассказала, что её команда вскоре опубликует полную ДНК образца вымершей птицы:

"«Геном дронта полностью секвенирован. Расшифровка генома ещё не опубликована, но она уже есть».

Однако исследовательница предупредила, что вернуть птицу к жизни будет сложно.

«Предположим, у меня есть клетка, и она живёт в чашке Петри в лаборатории, и я редактирую её так, чтобы в ней было немного ДНК дронта. Но как мне затем превратить эту клетку в целое живое, дышащее, настоящее животное? Способ, которым мы можем это сделать, – клонирование. Этот же подход использовался для создания овечки Долли. Но мы не знаем, как это сделать с птицами из-за сложности их репродуктивных путей.

Таким образом, для птиц нужен другой подход, и это действительно фундаментальное технологическое препятствие на пути к возвращению додо», – говорит Шапиро.

Додо получил свое название от португальского слова, означающего «дурак», после того, как колонизаторы высмеяли его бесстрашие перед людьми-охотниками. Это бесстрашие и привело вид к гибели.

Маврикийский дронт был высотой около метра и мог весить 10-18 кг. На картинах изображаемая птица имела коричневато-серое оперение, жёлтые ноги, небольшой пучок хвостовых перьев и серую, неоперённую в лицевой части голову с чёрным, жёлтым или зелёным клювом.

Исследования ДНК показали, что ближайшие родственники додо – вымерший родригесский дронт и современный гривистый голубь из Юго-Восточной Азии. Вполне вероятно, что ученые отредактируют ДНК голубя, чтобы включить в него ДНК дронта и вернуть птиц к жизни.

Сейчас учёные гораздо лучше могут представить внешность загадочной птицы и её жизнь – по следам их исследований мы сделали о дронтах целую инфографику.

Источник